DICCIONARIO MÉDICO
Inmunofluorescencia
La inmunofluorescencia es una técnica de laboratorio que emplea anticuerpos unidos a sustancias fluorescentes para localizar un antígeno o un anticuerpo concreto dentro de una muestra biológica. Cuando la preparación se ilumina con luz de una longitud de onda determinada, las estructuras marcadas emiten luz visible y quedan al descubierto bajo el microscopio. El término reúne dos piezas de origen distinto. La primera, inmuno-, procede del latín immunis, "exento" o "libre de carga", la misma raíz de la que deriva todo el vocabulario inmunológico. La segunda, fluorescencia, la acuñó el físico y matemático británico George Gabriel Stokes en 1852 a partir de la fluorita, el mineral en el que observó por primera vez ese resplandor bajo luz ultravioleta. Dos hechos, combinados, hacen posible este procedimiento. Un anticuerpo reconoce a su antígeno con enorme precisión, casi como una llave a su cerradura. Y ciertos colorantes, los fluorocromos, absorben luz de una longitud de onda y la devuelven en otra, un fenómeno de fluorescencia que el ojo percibe como un color brillante sobre fondo oscuro. Si se pega un fluorocromo a un anticuerpo sin estropear su capacidad de reconocimiento, ese anticuerpo se convierte en una baliza: allá donde encuentre su diana, la marcará con luz. La muestra (un corte de tejido, un frotis celular, un cultivo) se pone en contacto con los anticuerpos marcados. Tras un tiempo de incubación se lava lo que no se ha unido, y solo permanece el marcaje anclado a su antígeno. Bajo el microscopio de fluorescencia, una fuente de luz excita el fluorocromo y un juego de filtros deja pasar únicamente la luz que este emite. El resultado es un mapa luminoso de dónde está la molécula buscada. El fluorocromo clásico es el isotiocianato de fluoresceína, conocido por sus siglas inglesas FITC, que emite un verde característico. Se emplean también otros que rinden en el rojo o el naranja, lo que permite marcar dos o tres dianas distintas en la misma preparación y distinguirlas por color. La señal, eso sí, no es eterna: la exposición prolongada a la luz de excitación degrada el fluorocromo y apaga poco a poco su emisión, un inconveniente que obliga a fotografiar las preparaciones sin demora. Existen dos maneras de llevar el fluorocromo hasta el antígeno. En la inmunofluorescencia directa, el marcador viaja sobre el propio anticuerpo que reconoce la diana: un solo paso, un solo reactivo. En la inmunofluorescencia indirecta intervienen dos anticuerpos; el primero, sin marcar, se une al antígeno, y un segundo anticuerpo fluorescente se dirige contra el primero. Al poder acumularse varios anticuerpos secundarios sobre cada primario, la señal se amplifica y la sensibilidad aumenta. Conviene retener una idea. Esta división entre método directo e indirecto no es exclusiva de la fluorescencia: reaparece en el ELISA, en la citometría y en otras técnicas que se apoyan en anticuerpos, siempre con la misma lógica de un marcaje que llega en un paso o en dos. En 1941, Albert H. Coons, con Hugh Creech y Norman Jones en la Universidad de Harvard, describió el primer anticuerpo dotado de un grupo fluorescente y lo utilizó para señalar neumococos en tejido infectado. El primer marcador, un derivado del antraceno, emitía un azul que se confundía con el brillo natural del propio tejido. Coons lo cambió hacia 1942 por la fluoresceína, cuyo verde se recortaba con nitidez sobre ese fondo. La segunda dificultad la resolvió en 1950 junto a Matthew Kaplan, al adaptar el procedimiento a cortes de tejido congelado, que conservan mejor los antígenos. Aquellos ensayos abrieron un camino que no ha dejado de ampliarse. La fluoresceína convive hoy con familias enteras de fluorocromos sintéticos, y el microscopio de campo amplio ha cedido terreno al confocal y a las técnicas de superresolución. El principio, sin embargo, apenas ha cambiado desde el experimento original. La inmunofluorescencia se usa de dos formas complementarias. Puede buscar antígenos o depósitos que ya están fijados en una muestra del paciente, como los complejos inmunes depositados en la piel o en el riñón, o los propios microorganismos en una secreción. O puede rastrear anticuerpos circulantes en el suero, entre ellos los autoanticuerpos que aparecen en las enfermedades autoinmunes. De ahí su presencia en campos muy distintos: la dermatología recurre a ella para estudiar biopsias cutáneas; la nefrología, para examinar el patrón de depósito en la biopsia renal; la reumatología y la inmunología clínica, para detectar autoanticuerpos; y la microbiología, para identificar agentes infecciosos. La primera modalidad, la que trabaja sobre tejido, suele hacerse por método directo; la segunda, la del suero, por método indirecto. De la suma de dos términos. "Inmuno-" remite al latín immunis, exento, y enlaza con el sistema inmunitario que aporta los anticuerpos. "Fluorescencia" la nombró George Gabriel Stokes en 1852, tomándola de la fluorita, mineral que él vio emitir luz azulada bajo radiación ultravioleta. El nombre describe, por tanto, un fenómeno óptico puesto al servicio de la especificidad inmunitaria. En cuántos anticuerpos intervienen. La directa marca la diana con un único anticuerpo fluorescente en un solo paso. La indirecta usa dos, y consigue así amplificar la señal. Cada una tiene su entrada propia, la inmunofluorescencia directa y la inmunofluorescencia indirecta. Porque el fluorocromo se degrada. Cada vez que la luz de excitación incide sobre él, una fracción de las moléculas pierde de forma irreversible su capacidad de emitir, un proceso llamado fotoblanqueo. La señal se debilita con la observación y, aun guardada en oscuridad y frío, tiende a apagarse con las semanas. Por eso las imágenes se captan cuanto antes. No. Ambas usan anticuerpos para localizar antígenos en un tejido, pero se leen de manera distinta. La inmunohistoquímica revela la unión con una enzima que genera un depósito coloreado, visible con un microscopio óptico corriente y estable en el tiempo. La inmunofluorescencia emplea fluorocromos y exige un microscopio de fluorescencia. La elección entre una y otra depende del antígeno y del tipo de muestra.Qué es la inmunofluorescencia
Fundamento y desarrollo de la técnica
Inmunofluorescencia directa e indirecta
De Coons a la práctica actual
Aplicaciones
Preguntas frecuentes
¿De dónde viene la palabra inmunofluorescencia?
¿En qué se diferencian la variante directa y la indirecta?
¿Por qué las preparaciones no se conservan indefinidamente?
¿Es lo mismo que la inmunohistoquímica?
Referencias
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Infografías realizadas con https://BioRender.com
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