Fragmento de Klenow

Qué es el fragmento de Klenow

Hans Klenow e Inger Henningsen, del Instituto de Química Biológica de la Universidad de Copenhague, publicaron en 1970 que la proteólisis limitada de la ADN polimerasa I con subtilisina generaba dos fragmentos de distinto tamaño. El mayor, de unos 68 kDa (denominaciones posteriores lo sitúan en 76 kDa dependiendo de las condiciones de electroforesis), retenía la capacidad de sintetizar ADN y la de corregir errores de incorporación, pero no podía degradar cadenas de ADN en la dirección 5'→3'. El menor, de aproximadamente 34 kDa, conservaba únicamente esta última actividad exonucleasa.

¿Por qué importó tanto esa separación? La ADN polimerasa I completa, descubierta por Arthur Kornberg en 1956, resulta difícil de usar en muchas aplicaciones de laboratorio precisamente porque su actividad exonucleasa 5'→3' degrada el ADN recién sintetizado. El fragmento de Klenow resolvía el problema de forma elegante: polimeriza con fidelidad y corrige errores, sin destruir lo que acaba de construir.

Estructura del polipéptido

La arquitectura tridimensional del fragmento de Klenow fue resuelta por Thomas A. Steitz y colaboradores en 1985 mediante cristalografía de rayos X. Se organiza en dos dominios funcionales separados: el dominio polimerasa, que adopta la forma clásica de «mano derecha» con tres subdominios (palma, dedos y pulgar), y el dominio exonucleasa 3'→5', más pequeño, que alberga el sitio de edición donde se eliminan los nucleótidos incorrectamente incorporados.

Esa metáfora de la mano que sujeta el molde de ADN se ha extendido a toda la familia de ADN polimerasas de tipo A. El pulgar abraza la doble hélice recién sintetizada, los dedos se cierran sobre el nucleótido entrante y la palma contiene los residuos catalíticos que forman el enlace fosfodiéster. En el caso del fragmento de Klenow, la distancia entre el sitio activo de la polimerasa y el sitio de edición de la exonucleasa 3'→5' es de unos 30 angstroms, lo que permite al ADN desplazarse de uno a otro cuando se detecta un error de apareamiento.

Usos en el laboratorio

Antes de que las polimerasas termoestables relegaran al fragmento de Klenow a un segundo plano, fue la primera enzima utilizada para amplificar segmentos de ADN en las versiones iniciales de la reacción en cadena de la polimerasa. Kary Mullis, en sus primeros prototipos de PCR a mediados de los años ochenta, empleaba el fragmento de Klenow y debía reponer enzima fresca tras cada ciclo de desnaturalización, porque el polipéptido se inactivaba al calentar la mezcla a 94 °C. La sustitución por la Taq polimerasa de Thermus aquaticus eliminó esa necesidad y revolucionó la técnica.

El fragmento sigue ocupando, sin embargo, un nicho bien definido. Se utiliza de forma rutinaria para rellenar los extremos 5' protuberantes (fill-in) que dejan las endonucleasas de restricción, para el marcaje de sondas de ADN por el método de cebadores aleatorios (random priming) y para ciertas estrategias de mutagénesis dirigida. Existe además una variante denominada fragmento exo^- Klenow, en la que se han mutado los residuos catalíticos de la exonucleasa 3'→5' para eliminar también esa actividad; esta versión resulta preferible cuando se necesita una síntesis sin corrección, por ejemplo al añadir colas de desoxiadenina a los extremos de un producto de PCR.

Preguntas frecuentes

¿Quién fue Hans Klenow?

Bioquímico danés (1923-2009) adscrito al Instituto de Química Biológica de la Universidad de Copenhague. Su publicación de 1970, junto con Inger Henningsen, describió por primera vez la eliminación selectiva de la actividad exonucleasa 5'→3' de la ADN polimerasa I por proteólisis limitada. El fragmento lleva su nombre desde entonces.

¿Se puede usar el fragmento de Klenow para una PCR convencional?

Ya no. El fragmento se desnaturaliza a las temperaturas necesarias para separar las dos hebras del ADN (más de 90 °C), lo que obliga a añadir enzima nueva tras cada ciclo. Las polimerasas termoestables, capaces de soportar esos ciclos térmicos repetidos, lo sustituyeron a finales de la década de 1980.

¿Qué es el fragmento exo-negativo de Klenow?

Una versión modificada por mutagénesis dirigida en la que se anulan los residuos del sitio activo de la exonucleasa 3'→5'. El resultado es un polipéptido que solo polimeriza, sin degradar ni corregir. Se emplea cuando se necesita incorporar nucleótidos modificados o añadir colas homopoliméricas sin riesgo de que la actividad correctora los elimine.

Referencias

1. Klenow H, Henningsen I. Selective elimination of the exonuclease activity of the deoxyribonucleic acid polymerase from Escherichia coli B by limited proteolysis. Proc Natl Acad Sci USA. 1970;65(1):168-175. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC286206/
2. Ollis DL, Brick P, Hamlin R, Xuong NG, Steitz TA. Structure of large fragment of Escherichia coli DNA polymerase I complexed with dTMP. Nature. 1985;313(6005):762-766.
3. Klenow fragment. En: ScienceDirect Topics. Elsevier. Disponible en: https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/klenow-fragment
4. Wikipedia en español. Fragmento de Klenow. Disponible en: https://es.wikipedia.org/wiki/Fragmento_de_Klenow