Sds-electroforesis en gel de poliacrilamida

Qué es la SDS-PAGE

Las siglas proceden del inglés Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, es decir, electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico. En español conviven ambas formas, la sigla inglesa y la traducción literal, sin que ninguna haya desplazado del todo a la otra en los laboratorios de bioquímica y biología molecular. El dodecilsulfato sódico (SDS) es un detergente aniónico de doce carbonos, emparentado estructuralmente con muchos jabones y champús de uso doméstico, aunque aquí cumple una función muy distinta: desplegar las proteínas y cubrirlas de carga negativa antes de someterlas a un campo eléctrico.

La técnica pertenece a la familia general de la electroforesis en gel de poliacrilamida, de la que existe también una variante nativa, sin SDS, y comparte con ella la misma matriz porosa. Lo que distingue a la SDS-PAGE es precisamente el aditivo que le da nombre.

Fundamento: cómo el SDS iguala las proteínas

El dodecilsulfato sódico se une a la cadena polipeptídica en una proporción casi constante, en torno a 1,4 gramos de detergente por cada gramo de proteína, según establecieron Reynolds y Tanford en 1970. La cola hidrocarbonada del detergente se inserta en las regiones hidrófobas de la proteína, mientras su grupo sulfato queda expuesto hacia el disolvente. El resultado se ha descrito como una estructura en "collar de perlas", con segmentos de proteína recubiertos de SDS separados por tramos más flexibles. Esta unión masiva enmascara la carga eléctrica propia de cada proteína, de modo que todas terminan con una relación carga-masa prácticamente idéntica. Suele añadirse además un agente reductor, como el betamercaptoetanol o el ditiotreitol, que rompe los puentes disulfuro internos y permite separar las subunidades de las proteínas multiméricas. El calentamiento de la muestra completa la desnaturalización. Migran entonces solo por tamaño.

Origen: un método nacido de un problema muy concreto

Ulrich K. Laemmli no pretendía crear un método universal cuando publicó su artículo en Nature en 1970: estudiaba el ensamblaje de las proteínas de la cabeza del bacteriófago T4 y necesitaba una manera de resolver sus componentes con precisión. Combinó dos avances previos, cada uno desarrollado por otros investigadores, el sistema de tampones discontinuos descrito años antes por Ornstein y Davis, y la solubilización de complejos proteicos con SDS, ya empleada por Summers y sus colaboradores. El resultado tenía dos geles superpuestos con distinto pH y distinta concentración de poliacrilamida: uno superior, de concentración, donde las proteínas de la muestra se alinean antes de entrar en el segundo, el de separación propiamente dicho, donde se resuelven según su tamaño. Aquel artículo, pensado para resolver un problema puntual de virología, se convirtió con el tiempo en el segundo trabajo científico más citado de la historia, solo por detrás del método de Lowry para cuantificar proteínas, según el recuento que publicó la revista Nature en 2014.

Diferenciación con otras técnicas electroforéticas

La variante nativa de esta misma electroforesis, sin SDS, conserva la conformación tridimensional de la proteína y su carga original. Se emplea cuando interesa mantener la actividad biológica tras la separación, por ejemplo en ensayos enzimáticos, algo que la SDS-PAGE no permite al desnaturalizar la muestra. Frente a la electroforesis en gel de agarosa, la poliacrilamida ofrece poros mucho más finos y uniformes, apropiados para proteínas de tamaño pequeño y mediano, mientras que la agarosa se reserva casi siempre para ácidos nucleicos de mayor tamaño. La SDS-PAGE tampoco debe confundirse con la electroforesis bidimensional, que la incorpora como segunda dimensión tras un primer paso de enfoque isoeléctrico.

Uso en el laboratorio

En la práctica, la SDS-PAGE sirve sobre todo para tres fines: estimar el peso molecular aparente de una proteína por comparación con patrones de tamaño conocido, comprobar la pureza de una preparación proteica y separar las proteínas de una muestra compleja antes de transferirlas a una membrana para su identificación con anticuerpos específicos. La relación entre la movilidad electroforética y el logaritmo del peso molecular es aproximadamente lineal, lo que permite esa estimación mediante una recta de calibrado. No todas las proteínas se comportan según lo esperado. Las glucoproteínas o las proteínas de membrana, por ejemplo, pueden migrar a una posición que no se corresponde con su masa real, un fenómeno conocido como migración anómala.

Preguntas frecuentes

¿Qué significan las siglas SDS-PAGE?

Proceden del inglés Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis: electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico. El nombre describe con precisión los dos elementos que definen la técnica, el detergente y el soporte, sin dejar lugar a otra interpretación.

¿Puede la SDS-PAGE separar ácidos nucleicos?

No es su uso habitual. El ADN y el ARN ya tienen carga negativa uniforme por sí mismos y se separan mejor en geles de agarosa; la poliacrilamida con SDS se reserva casi siempre para proteínas.

¿Quién inventó la SDS-PAGE?

El bioquímico suizo Ulrich K. Laemmli publicó el protocolo que hoy se usa de forma casi universal en 1970, aunque partió de avances anteriores de otros grupos, como los tampones discontinuos y el propio uso del SDS como agente desnaturalizante. No trabajaba en ese momento con proteínas humanas: su objeto de estudio era el ensamblaje del bacteriófago T4.

¿Por qué se calienta la muestra antes de cargarla en el gel?

Porque el calor favorece que el SDS acceda a todas las regiones hidrófobas de la proteína y complete su desnaturalización. Sin este paso, algunas proteínas conservarían restos de su plegamiento original y migrarían de forma distinta a la esperada para su tamaño, falseando la estimación del peso molecular. Junto con el calor, suele añadirse un agente reductor que rompe los puentes disulfuro, necesarios en muchas proteínas para mantener unidas sus subunidades. Ambos pasos combinados garantizan que lo que se mueve por el gel sea una cadena polipeptídica lineal y no un fragmento aún replegado. Por eso los protocolos estándar fijan una temperatura y un tiempo de calentamiento concretos, en vez de dejarlo al criterio de quien realiza el ensayo. Las proteínas ricas en prolina o con modificaciones postraduccionales extensas, sin embargo, pueden resistirse parcialmente a este proceso.

Referencias

1. Nature. The top 100 papers.
2. PNAS. Detergent binding explains anomalous SDS-PAGE migration of membrane proteins.
3. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Alcalá. SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida. ChemEvol.
4. Cold Spring Harbor Protocols (PubMed). Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins.