Endonucleasa de restricción

Qué es una endonucleasa de restricción

En la naturaleza, las bacterias producen estas enzimas para fragmentar el ADN extraño que penetra en la célula, normalmente procedente de virus bacteriófagos. El ADN propio de la bacteria se protege mediante la acción de una metilasa complementaria que añade grupos metilo a las mismas secuencias que la restrictasa reconoce; el ADN metilado no resulta cortado. Esta pareja enzimática (restrictasa y metilasa) constituye el llamado sistema de restricción-modificación.

El nombre de restricción procede de los experimentos de Werner Arber a finales de los años sesenta: observó que ciertos bacteriófagos veían restringido su crecimiento en determinadas cepas bacterianas. La causa resultó ser la degradación enzimática del ADN viral. En 1970, Hamilton Smith aisló la primera enzima de restricción purificada a partir de Haemophilus influenzae (HindII). Daniel Nathans demostró poco después que estas enzimas podían utilizarse para cartografiar el genoma viral del SV40. Los tres recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1978.

Nomenclatura y clasificación

Cada enzima de restricción recibe su nombre del organismo del que se aisló. Las tres primeras letras se toman del género y la especie en cursiva (por ejemplo, Eco de Escherichia coli), seguidas a veces de la cepa y un número romano que indica el orden de descubrimiento en ese organismo. Así, EcoRI fue la primera enzima de restricción identificada en E. coli cepa RY13.

Se distinguen cuatro tipos principales:

Tipo I. Son complejos multisubunidad con actividades de restricción, modificación y reconocimiento en una misma holoenzima. Cortan el ADN en posiciones alejadas del sitio de reconocimiento, lo que limita su utilidad en el laboratorio.

Tipo II. Reconocen secuencias palindrómicas de 4 a 8 pares de bases y cortan dentro de esa secuencia o muy cerca de ella. Requieren magnesio como cofactor y carecen de actividad metilasa propia. Son las de mayor uso en biología molecular, precisamente por la previsibilidad de sus cortes. Se han catalogado varios miles.

Tipo III. Necesitan ATP y reconocen secuencias asimétricas. Cortan a unas 25 bases del sitio de reconocimiento. Su aplicación experimental es escasa.

Tipo IV. Actúan exclusivamente sobre ADN modificado (metilado o hidroximetilado), invirtiendo en cierto modo la lógica de los sistemas anteriores.

Secuencias palindrómicas y tipos de extremos

La mayoría de las enzimas de tipo II reconocen palíndromos, es decir, secuencias que se leen igual en dirección 5' a 3' en ambas hebras complementarias. EcoRI, por ejemplo, reconoce la secuencia GAATTC. Al cortar, puede generar extremos cohesivos (también llamados "pegajosos"), en los que una de las hebras queda más larga que la otra formando un saliente monocatenario, o extremos romos, en los que ambas hebras terminan al mismo nivel.

Los extremos cohesivos tienen una propiedad que resultó decisiva para la ingeniería genética: pueden aparearse con otros extremos generados por la misma enzima, sin importar el origen del ADN. Esa compatibilidad permitió, por primera vez, unir fragmentos de ADN de organismos distintos y crear moléculas de ADN recombinante.

Preguntas frecuentes

¿De dónde viene el nombre "enzima de restricción"?

Del fenómeno de restricción descrito por Werner Arber en la década de 1960. Arber observó que el crecimiento de ciertos bacteriófagos quedaba restringido en bacterias que poseían estas enzimas, capaces de fragmentar el ADN viral. El término se consolidó en la literatura científica tras los trabajos de Hamilton Smith y Daniel Nathans.

¿Cuántas enzimas de restricción se conocen?

Se han identificado varios miles, con más de 300 especificidades de secuencia distintas. La base de datos REBASE, mantenida por New England Biolabs, es el registro de referencia mundial. Solo una fracción de las descritas se comercializa y utiliza habitualmente en los laboratorios.

¿Qué relación tienen con CRISPR?

Conceptualmente, ambos son sistemas de defensa bacteriana frente a ADN invasor. Las enzimas de restricción reconocen secuencias fijas en el ADN; CRISPR-Cas9 utiliza un ARN guía para dirigir el corte a prácticamente cualquier secuencia elegida por el investigador. CRISPR ha ampliado enormemente las posibilidades de edición génica, pero las enzimas de restricción siguen siendo herramientas rutinarias en clonación molecular y análisis de polimorfismos.

Referencias

1. NHGRI (National Human Genome Research Institute). Restriction Enzyme.
2. MedlinePlus. Pruebas genéticas.
3. Nobel Prize. The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978.
4. Manual MSD (versión para profesionales). Tecnología del ADN recombinante (genómica).