Cromatografía líquida de alta presión (HPLC)

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Qué es la HPLC

Conviene aclarar, de entrada, que la HPLC no es un mecanismo de separación en sí misma. Es una plataforma instrumental que puede funcionar con distintos mecanismos: partición, adsorción, intercambio iónico o exclusión molecular, según el tipo de columna que se instale. Lo que la define no es cómo separa, sino con qué lo hace: partículas de fase estacionaria de entre 1,5 y 5 micrómetros de diámetro, empaquetadas en columnas metálicas cortas (normalmente de 5 a 25 cm), a través de las cuales se impulsa la fase móvil a presiones que pueden alcanzar varios cientos de bares.

Csaba Horváth, un ingeniero químico húngaro que trabajaba en la Universidad de Yale, presentó en 1966-1967 los primeros sistemas instrumentales que combinaban bombas de alta presión, inyectores de muestra y detectores en línea para la cromatografía líquida en columna. No fue el único: Jack Kirkland, en Du Pont, y Josef Huber, en los Países Bajos, contribuyeron simultáneamente al desarrollo instrumental. Pero fue la denominación que Horváth propuso, High Pressure Liquid Chromatography, la que acabó consolidándose, aunque con el tiempo se reinterpretó la P como Performance (rendimiento) para reflejar mejor las capacidades de la técnica.

Componentes del sistema

Un equipo de HPLC consta de un reservorio de disolventes, una bomba de alta presión, un inyector (manual o automático), una columna cromatográfica termostatizada y un detector que registra la señal de los componentes separados. Los detectores más habituales son los de absorbancia ultravioleta-visible y los de matriz de diodos, aunque en los últimos años la espectrometría de masas acoplada a HPLC (LC-MS) ha ganado protagonismo por su capacidad de identificar inequívocamente cada sustancia separada.

Aplicaciones en el laboratorio clínico

La determinación de la hemoglobina glicosilada (HbA1c), parámetro de referencia en el seguimiento de la diabetes, se realiza en la mayoría de los laboratorios mediante HPLC con columnas de intercambio catiónico. Los mismos equipos permiten detectar variantes estructurales de hemoglobina, lo que convierte la determinación rutinaria de HbA1c en un cribado incidental de hemoglobinopatías.

La monitorización de concentraciones plasmáticas de medicamentos (inmunosupresores, antiepilépticos, antirretrovirales) recurre cada vez más a la LC-MS por su especificidad. En toxicología clínica y forense, la HPLC acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) ha reemplazado en muchos centros al inmunoensayo como método de confirmación, porque permite detectar y cuantificar decenas de sustancias en una sola inyección de muestra.

De la HPLC a la UHPLC

A principios de la década de 2000 aparecieron sistemas capaces de trabajar con partículas de menos de 2 micrómetros y presiones superiores a 1000 bares. Esta evolución, conocida como UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography), reduce los tiempos de análisis y mejora la resolución cromatográfica. Muchos laboratorios clínicos y de control de calidad han migrado ya a esta plataforma.

Preguntas frecuentes

¿Qué significan las siglas HPLC?

High Performance Liquid Chromatography, que en español se traduce como cromatografía líquida de alta resolución o de alta presión. Originalmente la P significaba Pressure (presión), pero se reinterpretó como Performance (rendimiento) cuando las prestaciones del equipo superaron con creces las de la cromatografía clásica.

¿La HPLC es un tipo de cromatografía o una forma de hacer cromatografía?

Más bien lo segundo. La HPLC es una plataforma instrumental que puede operar con columnas de partición, de intercambio iónico, de exclusión molecular o de afinidad. El mecanismo de separación depende de la columna elegida; lo que aporta la HPLC es velocidad, resolución y automatización.

¿Para qué se usa la HPLC en un análisis de sangre?

Su uso más frecuente es la medición de la HbA1c para el control de la diabetes. También se emplea en la detección de hemoglobinopatías, en el análisis de aminoácidos plasmáticos y en la monitorización de niveles de medicamentos.

Referencias

1. Revista del Laboratorio Clínico (SEQCML/Elsevier). Desarrollo de procedimientos de medida basados en la cromatografía líquida de alta resolución.
2. Universidad Veracruzana, Instituto de Química Aplicada. Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC).
3. Universidad Nacional de La Plata, SEDICI. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): su aplicación al análisis farmacéutico.
4. NCBI/PMC. Optimización de un método de cribado rápido de fármacos en sangre mediante LC-MS/MS.