Cromatografía de filtración en gel o de exclusión

Qué es la cromatografía de filtración en gel

El nombre describe con bastante literalidad lo que ocurre en la columna: un gel formado por perlas porosas de tamaño controlado actúa como filtro molecular. Las moléculas más grandes que el diámetro de los poros quedan excluidas del interior de las perlas y recorren la columna por el espacio que queda entre ellas, con lo que eluyen primero. Las moléculas pequeñas, en cambio, penetran en los poros, siguen un camino más largo y tardan más en salir. El resultado es una separación ordenada por peso molecular decreciente.

Jerker Porath y Per Flodin, del Instituto de Bioquímica de la Universidad de Upsala, publicaron en 1959 la preparación de un gel de dextrano reticulado al que llamaron Sephadex, un soporte que se convirtió rápidamente en el estándar de la técnica. Poco antes, en 1956, Lathe y Ruthven habían descrito el principio de la separación por exclusión usando almidón como soporte, pero fue el trabajo del grupo sueco el que hizo practicable el método a escala de laboratorio.

Un mecanismo puramente físico

Lo que distingue a esta técnica del resto de modalidades cromatográficas es la ausencia de interacción química entre el analito y la fase estacionaria. No hay adsorción, no hay intercambio de cargas, no hay unión biológica específica. La separación se produce únicamente porque las moléculas de distinto tamaño recorren caminos de longitud diferente dentro de la columna. Eso tiene una consecuencia práctica muy apreciada: la muestra no sufre alteraciones durante el proceso, y las condiciones suaves de elución preservan la actividad biológica de proteínas y otras macromoléculas sensibles.

Cada gel se caracteriza por un rango de fraccionamiento, definido por dos límites de peso molecular. Por debajo del límite inferior, todas las moléculas penetran completamente en los poros y eluyen juntas. Por encima del límite de exclusión, todas quedan fuera de los poros y salen también juntas. La separación útil se produce entre ambos límites.

Aplicaciones en bioquímica y laboratorio clínico

La determinación del peso molecular de proteínas y polímeros biológicos ha sido históricamente la aplicación más conocida de esta técnica. Comparando el volumen de elución de una proteína desconocida con el de patrones de peso molecular conocido, se obtiene una estimación razonable de su masa. También se utiliza para desalinizar muestras de proteínas (las sales, al ser moléculas pequeñas, eluyen después), para cambiar el tampón de una preparación y para analizar el estado de agregación de proteínas terapéuticas.

En el laboratorio clínico, la técnica tiene aplicación en el estudio de inmunoglobulinas monoclonales y en el análisis de formas oligoméricas de proteínas plasmáticas. La industria biofarmacéutica la emplea como paso de control de calidad para verificar que un anticuerpo terapéutico no contiene agregados de alto peso molecular.

Preguntas frecuentes

¿Es lo mismo cromatografía de filtración en gel que cromatografía de exclusión molecular?

Sí. Son nombres distintos para la misma técnica. Se habla de filtración en gel cuando se utilizan geles hidrófilos (como Sephadex o agarosa) y disolventes acuosos. En cambio, cuando se emplean geles hidrófobos y disolventes orgánicos para separar polímeros sintéticos, se prefiere el término cromatografía de permeación en gel (GPC).

¿Qué tipo de moléculas eluyen primero en esta cromatografía?

Las más grandes. Al no caber en los poros de la fase estacionaria, recorren un camino más corto y salen antes de la columna.

¿La técnica altera las proteínas que se separan?

Generalmente no, y esa es una de sus ventajas. Como no hay interacción química con el soporte y la elución se realiza con tampones suaves, las proteínas conservan su estructura y actividad biológica. Conviene, eso sí, que la muestra sea pequeña en comparación con el volumen total de la columna para obtener una buena resolución.

Referencias

1. JoVE Science Education. Cromatografía de exclusión por tamaño.
2. Universidad de Córdoba, Departamento de Bioquímica. Cromatografía de filtración en gel.
3. LibreTexts Bioquímica. Cromatografía de exclusión en gel.
4. Waters Corporation. Guía para principiantes sobre cromatografía de exclusión por tamaño.